Wabak COVID-19 yang disebabkan oleh virus SARS Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) atau yang sebelumnya dikenali sebagai Novel Coronavirus (nCov) semakin memuncak di Malaysia dengan Perintah Kawalan Pergerakan Diperketatkan (PKPD) diaplikasikan di dua buah tempat di Sempang Renggam, Johor.

Rakyat Malaysia perlu rasa sangat bersyukur berada di negara yang mempunyai akses pengesanan COVID-19 yang sangat baik dan berkesan iaitu dengan menggunakan kaedah Multiplex Real Time -Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Kaedah ini merupakan kaedah yang lebih baik dalam mengesan virus SARS-CoV-2 berbanding kaedah rapid-test kit, kerana RT-PCR dapat mengesahkan sehingga 99% kepastian jenis virus yang menyerang seseorang manusia, berbanding rapid-test kit yang mengesan dalam lingkungan 60% sahaja ketepatannya.

Oleh yang demikian, statistik individu yang terjangkit dengan COVID-19 di Malaysia lebih ramai berbanding negara-negara tetangga yang kurang akses kepada kaedah pengesanan ini. Malaysia turut dilaporkan lebih efisien dalam membuat ujian saringan COVID-19 berbanding negara-negara ASEAN yang lain, malahan lebih baik daripada beberapa Negara Eropah.

Ketersediaan Makmal Pengesanan COVID-19 di Malaysia.

Menurut Datuk Dr Noor Hisham Abdullah, Ketua Pengarah Kesihatan Malaysia di laman web rasminya (https://kpkesihatan.com/2020/02/13/laboratory-readiness-for-detecting-the-2019-novel-coronavirus-2019-ncov-infection-in-malaysia/), pada mula virus ini menyerang Malaysia, Malaysia hanya memperuntukkan sebuah makmal untuk pengesanan COVID-19.

Makmal di Unit Virologi, Pusat Penyelidikan Penyakit Berjangkit, Institut Penyelidikan Perubatan (Institute for Medical Research, IMR) merupakan satu-satunya makmal yang menyediakan ujian diagnostik mengesan SARS-CoV-2 di Malaysia.

Makmal ini telah menggunakan kaedah konvensional RT-PCR menggunakan mesin  (rujuk Rajah 5) untuk mengesan kewujudan virus tersebut dalam sampel tisu tekak atau bahagian rongga hidung (nasopharyngeal swab).

Makmal tersebut juga telah membuat persediaan sebelum wabak ini merebak. Pada 3 Januari 2020, reagen untuk mengesan koronavirus telah disediakan oleh penyelidik-penyelidik di IMR ini.

Seterusnya, pada 11 Januari 2020, saintis dari China telah berjaya membuat jujukan genetik (genetic sequencing) virus ini lalu maklumat tersebut dikongsikan ke dalam database perkongsian (shared database).

Keadaan ini membolehkan ahli virologi di IMR menyediakan reagen jujukan (reagent sequences) yang dikenali sebagai primers dan probes khas untuk 2019-nCoV turut dapat disediakan pada 11 Januari 2020.

Tidak lama kemudian, Pertubuhan Kesihatan Sedunia turut mengeluarkan protokol untuk mengesan 2019-nCoV Real-Time PCR, teknik dengan primers dan probes yang hampir sama dengan yang dibina oleh penyelidik Malaysia di IMR.

Reagen untuk mengesan virus 2019-nCoV tiba di makmal virologi IMR pada 21 Januari 2020. Pada masa yang sama, Pusat Perubatan Universiti Malaya (PPUM) telah berkongsi ekstraks RNA daripada keluarga virus yang sama (2019-CoV) yang telah dinyahaktifkan untuk dijadikan kawalan positif kepada ujian 2019-nCoV ini.

Pada 22 Januari 2020, penyelidik IMR berjaya mengoptimasikan ujian RT-PCR nCoV dan reagen ini dihantar ke Makmal Kesihatan Awam Kebangsaan (MKAK) Sungai Buloh pada 24 Januari 2020 untuk mengesan penyakit tersebut.

Pada 25 Januari 2020, Makmal IMR telah mengesan kes pertama dalam kalangan Pesakit di Bawah Penyiasatan (PUI). Justeru itu, IMR telah menjalankan Latihan Pengendalian Real Time-PCR di 12 buah hospital kerajaan dan 5 Makmal Kesihatan Awam (MKA) seperti dalam infografik yang disediakan oleh IMR dan NIH (National Institute of Health atau Institut Kesihatan Negara).

Setiap hari (termasuklah cuti umum), semua pegawai makmal hospital terbabit dan MKA menerima sampel seawal 7 pagi dan diproses secepat mungkin menggunakan mesin Real Time-PCR dengan berpandukan primers dan reagen probes 2019-nCOV.

Langkah ini bagi memastikan keputusan RT-PCR tersebut dapat dikeluarkan dalam tempoh masa 24 jam. Walaubagaimanapun, sepanjang tempoh latihan, keputusan dapat dikeluarkan dalam jangka masa yang lebih cepat daripada jangkaan tersebut.

Pegawai makmal hanya dibenarkan mengendalikan mesin ini apabila mereka telah melalui ujian kompetensi dan wajib memakai Personnel Protective Equipment (PPE). Sampel dari hospital yang diambil akan direkodkan dalam buku log dan dibawa ke Makmal Biosafety Level 2 (BSL-2).

Hanya beberapa mikroliter sampel sahaja yang diasingkan menggunakan mikropipet di dalam persekitaran terkawal (di dalam lamina air flow) dan dinyahaktifkan, sebelum diuji dengan mesin RT-PCR. Pegawai atas talian (on-call) akan mengeluarkan keputusan pensampelan ini.

Setakat 24 Mac 2020, Malaysia berupaya menguji 7,000 sampel sehari. Jika keadaan penyebaran wabak ini semakin meruncing, Kementerian Kesihatan Malaysia akan meningkatkan kapasiti pengujian kepada 16,500 ujian sehari.

Bagaimana COVID-19 Boleh Dikesan Dengan RT-PCR?

Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ialah teknik yang biasa digunakan untuk mengesan kewujudan sesuatu jujukan DNA atau RNA, justeru itu dapat mengenallpasti jenis patogen yang berada dalam sesuatu sampel.

Proses ini memerlukan belanja yang besar dengan pengendalian yang sukar. Hal ini kerana setiap sampel yag diuji perlu menjalani ujikaji di peringkat mikro dengan menggunakan pakaian pelindungan khas PPE, ruang kerja yang sangat terkawal, reagen khas dan kemahiran mengendalikan mesin PCR.

Jika mesin PCR tidak dikendalikan dengan betul, keputusan yang baik tidak dapat diperolehi dan perlu diulang semula menggunakan reagen lain.

Real-Time PCR menggunakan konsep Polymerase Chain Reaction (PCR) pada masa sebenar. DNA polymerase ialah enzim yang digunakan untuk menghasilkan jujukan DNA baharu. Polymerase Chain Reaction pula ialah teknik menghasilkan banyak salinan (amplifikasi) bahagian tertentu DNA atau gen.

Kaedah ini dicipta oleh Kary Mullis, seorang ahli biokimia Amerika pada Tahun 1983 dan beliau memenangi Anugerah Nobel dalam Kimia pada Tahun 1993 di atas kejayaannya mencipta teknik ini.

Dengan menggunakan teknik ini, beribu-ribu malah berjuta-juta salinan sebahagian DNA tertentu boleh dihasilkan daripada bilangan DNA yang sangat kecil. Oleh itu, DNA atau RNA perlu diekstrak terlebih dahulu daripada keseluruhan sel dengan teknik pengekstrakan DNA. Kebiasaannya, teknik pengekstrakan DNA menggunakan kaedah emparan (centrifugation technique).

Untuk menjalan PCR, lima bahan utama diperlukan.

1. Templat DNA (sampel) untuk disalin
2. Primers, iaitu DNA pendek yang digunakan untuk memulakan tindak balas PCR. Primers dicipta untuk mengikat kedua-dua bahagian DNA yang hendak disalin.
3. Asas DNA nukleotida molekul (A, C, G dan T). Molekul ini adalah bahan binaan DNA baharu yang juga dikenali sebagai dNTPs.
4. Enzim tag polymerase untuk memasukkan asas DNA nukleotida ke dalam jujukan yang dimulakan oleh primer.
5. Pemalar (buffer) untuk memastikan keadaan yang betul untuk tindak balas.

PCR memerlukan proses kitaran pemanasan dan penyejukan yang dipanggil kitar terma (thermal cycling) atau dipanggil termocycling. Hal ini bagi memastikan tiga peringkat duplikasi jujukan DNA boleh dihasilkan iaitu proses “denaturing”, “Annealing” dan “Extending.”

Semasa fasa “denaturing,” sampel DNA akan dipanaskan sehingga 95°C untuk memutuskan ikatan-ikatan hidrogen di antara dua jujukan DNA dan memisahkan jujukan ganda dua kepada jujukan tunggal sahaja. Proses ini mengambil masa dalam 30 saat.

Kemudian, sampel memasuki fasa “annealing” sampel disejukkan ke suhu 50 – 65°C. Keadaan ini membolehkan primers mengikat pada lokasi yang spesifik di jujukan DNA tunggal dengan ikatan hidrogen. Primers adalah jujukan DNA tunggal pendek iaitu yang mengandungi 20 ke 30 molekul asas sahaja.

Primers ini diciptakan supaya melengkapi (complementary) jujukan DNA sesuatu sampel yang unik kepada jenis DNA yang ingin dikaji. Primers untuk penyakit COVID-19 ialah Primers yang mengandungi jujukan DNA pendek yang “complement” dengan bahagian DNA virus SARS-CoV-2 (2019 n-CoV).

Primers akan menjadi titik permulaan DNA untuk disintesiskan. Enzim polymerase hanya boleh memasukkan molekul asas (bases) DNA selepas primer telah mengikat pada jujukan DNA. Jika sampel tiada maklumat DNA virus tersebut, proses penyalinan tidak berlaku dan pengesanan menjadi negatif.

Dua jujukan DNA tunggal yang terpisah mempunyai bahagian yang melengkapi (complementary). Oleh itu, dua jenis primers digunakan untuk mengikat pada kedua-dua jujukan tersebut, iaitu “forward primers” dan “reverse primers”.

Langkah memasukkan primers ini mengambil masa dalam 10 ke 30 saat sahaja.

Fasa terakhir ialah fasa “extending” iaitu base nukleotida akan disambung daripada primers, lalu jujukan ganda dua DNA baharu akan dihasilkan. Fasa ini memerlukan suhu setinggi 72°C untuk membolehkan enzim taq DNA polymerase berfungsi memasukkan molekul DNA baharu ke primers.

Enzim ini diekstrak daripada bakteria Thermus aquaticus, sejenis bakteria yang hidup pada suhu yang tinggi (80°C) di kolam air panas. Enzim pada bakteria ini sangat unik kerana ia boleh bertahan pada suhu yang tinggi. Enzim polymerase pada organisma lain biasanya akan rosak pada suhu lebih 60°C.

Pada suhu 72°C, Taq polymerase mencapai suhu optimum untuk memasukkan molekul DNA ke dalam jujukan baharu yang dimulakan oleh primers dan mengambil masa selama lebih kurang 1 minit untuk menyiapkan jujukan DNA sepanjang 1,000 molekul DNA base (1Kb).

Ketiga-tiga proses ini diulang sebanyak 20 ke 40 kali. Setiap satu proses akan menghasilkan dua jujukan DNA yang sepadan, iaitu mengikut strain RNA virus yang dikaji. Jika 20 kali, ia akan menghasilkan sehingga dua juta salinan jujukan DNA. (1 jadi 2, 2 jadi 4, 4 jadi 8, 16 jadi 32 dan seterusnya bagi setiap kitaran).

Setelah Proses PCR selesai, kaedah electrophoresis akan digunakan untuk menguji kuantiti dan saiz fragment DNA yang dihasilkan. Keputusan daripada gel electrophoresis ini akan menentukan seseorang itu mengalami penyakit COVID-19 ataupun tidak.

Kaedah pengesanan COVID-19 di Malaysia menggunakan teknologi kejuruteraan genetik dan memerlukan kos yang sangat tinggi. Setiap satu sampel yang diuji bernilai lebih RM 500. Namun begitu, kecanggihan teknologi di Malaysia membolehkan kos ini dikurangkan kerana makmal IMR boleh menghasilkan primers tersendiri.

Kos dan kaedah yang sukar ini membuktikan kesungguhan Malaysia dalam mengesan dan menangani penyakit ini. Justeru, diharapkan agar semua rakyat Malaysia dapat mematuhi arahan Perintah Kawalan Pergerakan (PKP) supaya kita tidak terkena jangkitan wabak ini.

Mari kita memainkan peranan sebagai seorang warganegara Malaysia untuk mematuhi perintah ini. Semoga gelombang penyebaran penyakit COVID-19 boleh disekat dan masalah ini berakhir dengan cepat.

*Nota: Penulis ialah Graduan Bachelor Sains (Bioteknologi) UPM, 2006.

RUJUKAN:

CDC, Coronavirus Disease 2019 (COVID-2019), Guidelines for Clinical Specimens, retrieve from https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html , at March 26, 2020.

WHO, Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans, retrieve from https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance , at March 26, 2020.

DG of Health (Feb 13, 2020), Laboratory Readiness for Detecting the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) infection in Malaysia, retrieve from https://kpkesihatan.com/2020/02/13/laboratory-readiness-for-detecting-the-2019-novel-coronavirus-2019-ncov-infection-in-malaysia/ , retrieve at March 26, 2020.

Reuters (March 24, 2020), Covid-19: Health Ministry to increase testing to 16,500 daily, retrieve from https://www.nst.com.my/news/nation/2020/03/577632/covid-19-health-ministry-increase-testing-16500-daily, at March 26, 2020.

CDC (March 15, 2020),CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, Instruction For Use, Atlanta, CDC.

Jennifer Harcourt, et al. (2020), Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with 2019 Novel Coronavirus Disease, United States, CDC, Atlanta.

Nao, N., et al. (2020), Detection of second case of 2019-nCoV infection in Japan, National Institute of Infectious Diseases, Shinjuku, Tokyo.

Laura E. Lamb, et al. (2020), Rapid Detection of Novel Coronavirus (COVID-19) by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification, Oakland University William Beaumont School of Medicine, Rochester Hills, USA.