4 Oktober tahun ini menjadi tarikh keramat bagi memberi penghargaan dalam kajian kimia biomolekul apabila pemenang anugerah Nobel untuk kategori kimia diumumkan. 3 saintis yang terlibat dalam membangunkan teknologi mikroskop molekul bio diumumkan sebagai pemenang; Richard Henderson, Joachim Frank dan Jacques Dubochet.

Video 1: Sidang media pengumuman pemenang anugerah Nobel kimia 2017.
Teknik mikroskop yang bertujuan untuk melihat struktur molekul telah lama dicipta. Sebagai permulaan contohnya, teknologi mikroskop elektron telah wujud sejak tahun 1926 lagi1. Kemudian pada tahun 1933 Ernst Ruska telah menghasilkan mikroskop elektron2 yang boleh mencapai resolusi imej objek yang lebih baik daripada mana mana mikroskop cahaya; mikroskop elektron boleh melihat struktur yang lebih kecik daripada 0.2 mikrometer3 (had pembiasan cahaya tampak). Pencapaian ini memberi peluang untuk Ruska menerima anugerah Nobel dalam bidang fizik pada tahun 19862.

Video 2: Gambaran ringkas bagaimana mikroskop elektron transmisi berfungsi. Video hak milik Jubobroff.

Setahun selepas Ruska memperkenalkan mikroskop elektronnya, Ladislaus Marton menunjukkan bahawa mikroskop elektron tidak sesuai untuk melihat spesimen biologi kerana dos elektron yang digunakan dalam sistem mikroskop elektron terlalu tinggi sehingga memusnahkan molekul bio4. Hal ini kerana pembedilan elektron terhadap molekul bio boleh merubah struktur (merosakkan) biomolekul. Tambahan pula, keadaan ruang vakuum yang tinggi di mana spesimen diletakkan juga mampu merosakkan struktur molekul bio.

Teknologi melihat struktur molekul menggunakan mikroskop elektron dikembangkan lagi apabila mikroskop elektron transmisi imbasan diperkenalkan pada tahun 1970⁶. Tidak lama kemudian, sekitar tahun 80-an, mikroskop daya atomik dicipta oleh pengkaji daripada syarikat IBM⁶. Jenis mikroskop ini masing masing mempunyai kelebihan dan kekurangannya tersendiri, jadi adalah satu kemestian untuk menentukan apa yang mahu dilihat sebelum memilih jenis mikroskop yang sesuai untuk digunakan. Namun setakat ini, teknologi untuk melihat spesimen molekul bio masih pada peringkat bayi. Mikroskop elektron transmisi masih hanya mampu menghasilkan imej pada resolusi 0.5 nanometer.

Terdapat juga teknologi seperti spektroskopi resonans magnet nukleus (NMR) dan kristalografi sinar X yang boleh digunakan untuk mendapatkan imej struktur molekul bio. Tetapi teknologi ini masing masing mempunyai batasannya yang tersendiri. NMR, walaupun penghasilan struktur imej molekul bio nya hampir kepada struktur molekul sebenar, hanya mampu menghasilkan data struktur bagi molekul bio yang kecil sahaja. Hal ini akan menjadi masalah apabila objek bio yang mahu dilihat besar seperti virus ataupun kompleks protein. Malah, spesimen molekul bio wajib dilarutkan⁷.

Kristalografi sinar X pula memerlukan bahan molekul bio tersebut dihablurkan terlebih dahulu sebelum dianalisa. Penghabluran protein merupakan satu usaha yang sangat rumit kerana tidak semua protein boleh dihablurkan, dan jika boleh, prosesnya amat rumit dan sukar dilakukan. Walaupun begitu, resolusi struktur yang boleh didapati masih pada peringkat yang kurang memuaskan⁷.

Maka dengan cabaran cabaran seperti inilah teknologi yang memenangi anugerah Nobel kimia pada tahun ini dikembangkan. Teknologi ini dinamakan pengimejan mikroskop elektron krio (ME-krio). Ia mula dikembangkan pada tahun 1982 oleh Jacques Dubochet mengikuti perkembangan pewarnaan negatif untuk mikroskopi elektron sebelum itu⁸.

Dubochet dan rakannya Alasdair McDowall menjumpai kaedah yang membenarkan mereka untuk membentuk lapisan filem air terkaca (vitrified water) di atas jaringan karbon⁹. Air terkaca merupakan satu jenis bahan pepejal air yang tidak mempunyai sifat hablur; mereka mempunyai struktur amorfus seakan akan kaca. Medium air dalam keadaan terkaca diperlukan kerana hablur air yang terbentuk daripada penyejukan biasa air akan merembatkan sinar elektron dan merosakkan imej objek yang dilihat menggunakan mikroskop elektron. Lapisan air terkaca di atas jaringan karbon ini perlu ditempatkan dalam persekitaran bersuhu -160ºC kebawah.

Kaedah digunakan Dubochet boleh dikatakan seperti mencuba untuk memegang debunga menggunakan penapis yang basah, lalu menggunakan keseluruhan perkakasan tersebut untuk melihat struktur debunga.

Tahun 1984 menyaksikan kaedah yang dicipta Dubochet diaplikasikan secara menyeluruh¹⁰. Dalam dapatan kajian oleh kumpulan yang dketuai Adrian (Dubochet juga terlibat), mereka telah membentuk lapisan air yang cukup nipis untuk disejukkan secara cepat untuk terkaca, tetapi cukup tebal untuk memegang satu lapisan molekul/kompleks molekul dalam keadaan semula jadinya. Dalam kes dapatan kajian ini, mereka melihat struktur virus hutan semliki.

Joachim Frank mula memasuki arena apabila beliau menangani masalah di mana imej molekul bio yang terhasil daripada kajian kelihatan kabur dan tidak jelas hasil daripada keadaan molekul yang tersusun secara rawak, bukan hablur, tidak simetri dan tidak diwarnakan¹¹.

Frank kemudiannya menggunakan fungsi penyekaitan silang untuk menyusun imej-imej mikroskop elektron¹². Akhirnya pada tahun 1981, Frank dan Marin Van Heel berjaya menghasilkan satu kaedah untuk mengenal pasti objek serta mengasingkannya berdasarkan orientasi dan struktur luarannya^13,14. Hal ini membolehkan kita mengenal pasti dan mengambil banyak imej objek yang kelihatan sama walaupun sebenarnya imej-imej tersebut daripada objek yang berlainan. Frank dan Michael Radermacher kemudiannya memperkenalkan kaedah untuk menggabungkan gambar gambar 2D daripada mikroskop elektron kepada satu intrepretasi 3D molekul bio yang dinamakan penyengetan konikal rawak^15,16.

Hasilnya, mereka telah mengumpulkan alatan matematik yang diperkembangkan untuk tujuan yang dinyatakan dalam perenggan sebelum ini ke dalam satu perisian bernama SPIDER. Perisian ini membenarkan imej daripada banyak objek kabur yang mempunyai orientasi yang sama ditindihkan bersama untuk menghasilkan imej yang beresolusi tinggi. Imej 2D yang beresolusi tinggi ni pula disusun untuk menjadi objek 3D yang mirip dengan molekul bio dalam dunia sebenar^17,18.

Richard Henderson sebenarnya sudah mula berkecimpung dalam bidang mikroskopi molekul bio sejak 1975 lagi apabila beliau dan Nigel Unwin melihat protein bakteriorhodopsin¹⁹. Tetapi kaedah yang digunakan hanyalah kaedah mikroskop elektron transmisi. Henderson menggunakan larutan glukosa untuk menggantikan air untuk menyaluti spesimen hablur protein. Kaedah tersebut digunakan untuk menyelamatkan struktur protein tersebut daripada keadaan vakuum tinggi ruangan spesimen di dalam mikroskop elektron.

Pada tahun 1990 pula Henderson menyatakan bahawa untuk mendapatkan imej beresolusi tinggi dengan cara mempuratakan salinan molekul bio di dalam mikroskopi elektron krio²⁰. Henderson kemudian menyatakan halangan-halangan dalam memperoleh imej yang baik, salah satunya ialah had memprosesan komputer pada waktu itu^21,22. Resolusi imej terbaik yang boleh didapati pada ketika ini ialah 0.5 nanometer. Frank berkata kepada penemu ramah “kami seakan akan tersekat pada tahap itu.”

Walaupun usaha 3 pemenang ini telah berlaku sebelum millenia yang baharu, tidak bermakna perkembangan teknologi mikroskopi elektron krio terhenti sehingga itu sahaja. Malah, banyak kemajuan pada teknologi itu berlaku sejak 10 tahun yang lepas. Henderson berjaya menggesa supaya pengesan berasaskan filem ditukar kepada pengesan digital dalam mikroskop elektron krio^24-29 memberikan dapatan yang sangat memberansangkan!; kini imej 3D pada peringkat resolusi atomik berjaya dihasilkan. Resolusi yang mampu bersaing dengan kristalografi sinar X kini telah wujud.

Kualiti imej yang dapat dihasilkan juga semakin meningkat dengan penambahbaikan terhadap beberapa sektor seperti penembak pancaran medan (oleh Albert Crewe), pentas sejuk kukuh, plat fasa Volta, pengumpulan data automatik dan algoritma kemungkinan maksimum. Walaupun dengan kemajuan kemajuan seperti ini, tidak bermakna tiada lagi penambahbaikan boleh dibuat ke atas teknologi ME-krio ini. Para para saintis, terutamanya dalam bidang biologi molekul, masing masing meletakkan cabaran baharu terhadap teknologi ini^31-32.

Akhirnya, kita telah mempunyai kaedah untuk mengintai molekul bio pada skala atomik tanpa perlu untuk menghablurkan bahan tersebut terlebih dahulu. Sarah Butcher, pakar mikroskopi elektron krio di Universiti of Helsinki memberikan komen “Dengan teknologi pengesan elektron digital diperkenalkan, kita boleh mengumpul semua data untuk menghasilkan imej pada skala atomik seperti yang dilakukan pakar kristalografi. Cuma kita sudah tidak perlu menghablurkan bahan spesimen terlebih dahulu, dan itu merupakan satu perkara yang bagus. Hablur sangat memeningkan kepala!”

Venki Ramakrishnan, ahli biologi struktur merangkap pemenang anugerah Nobel tahun 2009 memberikan komen “Teknologi ini telah merevolusikan dunia kajian struktur molekul bio”. Tetapi sebagai pakar kristalografi, Ramakrishnan juga menyatakan “Tiada siapa lagi di dalam makmal saya yang mahu menyediakan piring penghabluran dan berdoa agar hablur terbentuk.”. Pernyataan beliau menggambarkan betapa sukarnya untuk menghablurkan bahan bio³³.

Apakah impak yang diberikan oleh penciptaan teknologi ME-krio ini? Memberikan dunia mata yang dapat melihat dengan jelas dunia molekul mampu memberi potensi untuk kita mengkaji struktur molekul bio secara teliti. Pengetahuan struktur molekul bio secara teliti membolehkan kita meramal bagaimana ia berinteraksi dengan persekitaran. Tidak mustahil kita boleh mengenalpasti bahan yang sesuai untuk mengubati sesuatu penyakit dalam satu malam, atau mungkin dalam masa beberapa jam. Interaksi molekul bio merupakan satu proses yang terlibat dalam semua aktiviti kehidupan. Melihat kehidupan seharian secara terus pada skala atom mampu memberikan petunjuk dalam bidang perubatan, pertanian, bioteknologi dan lain lain. Kebolehan ini merupakan anugerah tuhan yang lahir daripada dunia yang sejuk. Satu sisi yang sebelum ini ghaib telah terbuka kepada mata manusia.

Sebagai contohnya, dalam kejadian wabak Zika baru baru ini di Brazil³⁴, satu kumpulan pengkaji telah membina model struktur virus zika dalam masa hanya beberapa bulan. Pengetahuan struktur virus zika membenarkan kita untuk meramal tapak tapak aktif yang sesuai untuk diserang menggunakan ubat ubatan, sekaligus mencacatkan usaha virus tersebut untuk berganda.

Walaupun begitu, adalah wajib untuk mengetahui bahawa sains bukan bidang kerja individu. Bahkan tetapi dunia sains merupakan dunia yang memerlukan para pengkaji berganding bahu serta berkongsi dapatan kajian dalam usaha mengembangkan pengetahuan. Oleh itu saya ingin menjelaskan terdapat juga nama nama yang tidak termasuk dalam senarai anugerah Nobel kimia yang juga terlibat dalam penambahbaikan teknologi ME-krio seperti Ladislaus Marton, Walter Hoppe, David DeRosier, Robert Glaeser, Nigel Unwin, Basile Luyet, Kenneth Taylor, Marin van Heel, Michael Radermacher, Alasdair McDowall, A.R. Faruqi dan ramai lagi nama nama yang tidak dapat disebutkan oleh kerana terlalu ramai bilangannya.

Sebagai penutup, dibawah ialah ringkasan jasa pemenang terhadap perkembangan teknologi ME-krio:

1. Jacques Dubochet – menghasilkan kaedah penyediaan spesimen molekul bio di dalam medium air untuk digunakan dalam ME-krio.
2. Joachim Frank – menghasilkan kaedah untuk menentukan struktur molekul bio daripada data yang dianalisa daripada sekumpulan molekul bio.
3. Richard Henderson – Menunjukkan bahawa penghasilan imej resolusi tinggi daripada ME-krio adalah tidak mustahil.

Rujukan

1. Mulvey, T. (1996). The growth of electron microscopy. San Diego: Academic Press.
2. Ruska, Ernst (1986). “Ernst Ruska Autobiography”. Nobel Foundation. Retrieved [2017-10-4].
3. Tortora, G., Funke, B. and Case, C. (2016). Microbiology. Harlow: Pearson.
4. Marton, L. (1934) Electron microscopy of biological objects. Nature 133, 911-911.
5. Crewe, A., Isaacson, M., Johnson, D. (1969). “A Simple Scanning Electron Microscope”. Review of Scientific Instruments. 40 (2): 241–246.
6. Binnig, G., Quate, C., Gerber, C. (1986). “Atomic Force Microscope”. Physical Review Letters. 56: 930–933.
7. Nogales, E. (2015). The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods, 13(1), pp.24-27.
8. Dubochet, J., and McDowall, A. W. (1981) Vitrification of pure water for electron microscopy.Journal of Microscopy. 124, 3-4
9. Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., and McDowall, A. W. (1985) Emerging techniques: Cryo-electron microscopy of vitrified biological specimens. Trends Biochem. Sci. 10, 143-146
10. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., and McDowall, A. W. (1984) Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 308, 32-36
11. Frank, J. (1975) Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects.Ultramicroscopy 1, 159-162

12. Saxton, W. O., and Frank, J. (1977) Motif detection in quantum noise-limited electron micrographs by cross-correlation. Ultramicroscopy 2, 219-227
13. van Heel, M., and Frank, J. (1981) Use of multivariates statistics in analysing the images of biological macromolecules. Ultramicroscopy 6, 187-194
14. Frank, J., and van Heel, M. (1982) Correspondence analysis of aligned images of biological particles. Journal of Molecular Biology. 161, 134-137
15. Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., and Frank, J. (1986) A new 3D reconstruction scheme applied to the 50s ribosomal subunit of E. coli. J. Microsc. 141, RP1-RP2
16. Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., and Frank, J. (1987) Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. Journal of Microscopy. 146, 113-136
17. Frank, J., and Shimkin, B. (1978) A new image processing software system for structural analysis and contrast enhancement. In: Proc. 9th Intern. Congr. on Electron Microscopy, Ed. J.M. Sturgess (Microscopical Society of Canada, Toronto, Ontario, 1978) I, 210
18. Frank, J., Shimkin, B., and Dowse, H. (1981) SPIDER-A modular software system for electron image processing. Ultramicroscopy 6, 343-357
19. Henderson, R., and Unwin, P. N. T. (1975) Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy. Nature 257, 28-32
20. Henderson, R., Baldwin, J. M., Ceska, T. A., Zemlin, F., Beckmann, E., and Downing, K. H. (1990). Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. Journal of Molecular Biology. 213, 899-929
21. Henderson, R. (1995) The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Review of Biophysic. 28, 171-193
22. Glaeser, R. M. (1999) Review: Electron crystallography: present excitement, a nod to the past, anticipating the future. Journal of Structural Biology. 128, 3-14
23. Pennycook, S., Varela, M., Hetherington, C. and Kirkland, A. (2006). Materials Advances through Aberration-Corrected Electron Microscopy. MRS Bulletin, 31(01), pp.36-43.
24. Faruqi, A. R., Henderson, R., Pryddetch, M., Allport, P., and Evans, A. (2005) Direct single electron detection with a CMOS detector for electron microscopy. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, A 546, 170-175
25. Xuong, N. H., Milazzo, A. C., Leblanc, P., Duttweiler, F., Bouwer, J., Peltier, S., Ellisman, M., Denes, P., Bieser, F., Matis, H. S., Wieman, H., and Kleinfelder, S. (2004) First use of a high sensitivity active pixel sensor array as a detector for electron microscopy. In Proceedings of SPIE – the International Society for Optical Engineering
26. Milazzo, A. C., Leblanc, P., Duttweiler, F., Jin, L., Bouwer, J. C., Peltier, S., Ellisman, M., Bieser, F., Matis, H. S., Wieman, H., Denes, P., Kleinfelder, S., and Xuong, N. H. (2005) Active pixel sensor array as a detector for electron microscopy. Ultramicroscopy 104, 152-159
27. McMullan, G., Faruqi, A. R., and Henderson, R. (2016) Direct electrondetectors. In Methods in Enzymology (Crowther, R. A. ed.), Academic Press. pp 1-17
28. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., and Cheng, Y. (2013) Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution singleparticle cryo-EM. Nature Methods 10, 584-590 16 (16)
29. McMullan, G., Clark, A. T., Turchetta, R., and Faruqi, A. R. (2009) Enhanced imaging in low dose electron microscopy using electron counting. Ultramicroscopy 109, 1411-1416
30. Heide, H. G. (1982) Design and operation of cold stages. Ultramicroscopy 10, 125-154
31. Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., and Baumeister, W. (2014) Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Science. USA 111, 15635-15640
32. Suloway, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Cheng, A., Guerra, F., Quispe, J., Stagg, S., Potter, C. S., and Carragher, B. (2005) Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology 151, 41-60
33. Stokstad, E. (2017). A cold, clear view of life wins chemistry Nobel. Science.
34. Sikka, Veronica, Chattu, Vijay Kumar, Popli, Raaj K., et al. (2016). “The emergence of zika virus as a global health security threat: A review and a consensus statement of the INDUSEM Joint working Group (JWG)”. Journal of Global Infectious Diseases. 8 (1): pp 3–15
35. Sirohi, D., Chen, Z., Sun, L., Klose, T., Pierson, T., Rossmann, M. and Kuhn, R. (2016). The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science, 352(6284), pp.467-470.
36. Kostyuchenko, V., Lim, E., Zhang, S., Fibriansah, G., Ng, T., Ooi, J., Shi, J., and Lok, S. (2016). Structure of the thermally stable Zika virus. Nature. 533, pp 425–428
37. Frank, J. (2017). Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols 12, pp 209–212